Cell Elizabeth Sattely团队揭秘石蒜科生

Cell Elizabeth Sattely团队揭秘石蒜科生物碱合成新途径再登顶刊 应粉丝要求，测评出光IFG5全合成机油的具体使用表现， 

Cell Elizabeth Sattely团队揭秘石蒜科生物碱合成新途径再登顶刊

植物中积累的大量真核毒素，不仅在其自身抗逆过程中扮演重要角色，而且在人类医药健康领域也具有重要的开发价值。石蒜科植物作为传统中药材，分布广泛、资源丰富，具有多种重要的食用、观赏和药用价值。石蒜科植物富含大量生物碱类化学成分，近年来随着石蒜科植物生物碱类化学成分、药理作用的深入研究，生物碱的种类、数量不断增加，药理作用不断丰富，但大多数石蒜科植物生物碱类化学成分的研究还是处于起步阶段，极大限制了这类药物的大规模生产。2024年9月13日，美国斯坦福大学化学系Elizabeth Sattely 团队在国际顶尖学术期刊Cell 上发表了题为“A developmental gradient reveals biosynthetic pathways to eukaryotic toxins in monocot geophytes”的研究论文，研究了石蒜生物碱（Amaryllidaceae alkaloids, AmAs）的生物合成途径及其发育相关机制。

1.同位素标记研究确定叶基是活性生物合成的位点

广义上讲，AmA生物合成途径包括三个主要分支——（例如石蒜碱lycorine）、(例如haemanthamine)和 (例如加兰他敏galantamine)途径，每个途径的命名都源于这些途径第一步发生的氧化偶联反应区域（图1）。尽管之前已经报道了多种石蒜科植物转录组和代谢物分析研究，但只有途径的酶被鉴定出来。这些酶包括一个关键的氧化偶联酶CYP96T1，它生成骨架，以及一个还原酶，该还原酶生成haemanthamine生物合成中的副产物。目前尚不清楚另外两个途径，和 是否也与途径在球茎内共同表达和共同调控。对于像水仙花这样的非模式植物，基因组信息和遗传工具往往不可用，生物合成活性组织的RNA-seq表达测序是识别候选途径酶的主要方法。然而，在不了解途径表达位置的情况下对植物进行转录组测序可能会导致采样不足。因此，作者试图了解三种不同生物合成途径中生物碱积累和生产的模式。

首先使用液相色谱质谱（LC-MS）比较了盛开时水仙花品种Tête-à-Tête () 不同组织中三种AmA途径（和）关键生物碱的丰度。在几个组织中检测到三种途径关键代谢物都处于高水平，但在某些情况下，它们的积累彼此不同，这些代谢物要么在被检测到的组织中生成，要么从不同来源生成组织被分配运输到其积累部位，这与之前在其他水仙花中的报道一致。

为了区分这两种可能性并在RNA测序实验中捕获活性生物合成的位置，作者直接测量了植物不同组织部位的活性生物合成。在水仙花的叶子里，细胞分裂和伸长发生在球茎内，因此叶子最幼嫩的部位位于球茎器官核心的叶基部。作者将不同水仙花组织切片，包括球鳞片和叶组织，浸泡在一种同位素标记的前体溶液中，[H]-4-O’-methylnorbelladine ([H]-4OMN)。标记的二烷基胺[H]-4OMN是三个AmA途径第一步骤的共有底物。处理之后，作者通过液相色谱-质谱（LC-MS）以非靶向的方式分析了代谢提取物，寻找在摄入底物的组织中相对于对照组显著富集的标记下游AmA途径代谢物。

图1 石蒜科生物碱（AmAs）是一组结构多样的生物活性生物碱，在生物学上具有相关性。

三个途径关键生物碱在水仙花叶片部分都高表达，这些天然积累的生物碱含量最高的是叶子最老的部分，对应于叶子的最顶部（图2a）。相反，最低的出现在最幼嫩、新发育的叶子部分，最靠近鳞茎地下的基部。当作者通过追踪同位素标记的 途径中间体[H]-vittatine（即haemanthamine前体）的产生来衡量活性生物合成时，发现活性生物合成在叶片的最底部（即最幼嫩、生长活跃的部分）最高，并向叶片的最顶部（即最老的部分）逐渐降低。因此，尽管叶子最幼嫩的部分积累的生物碱毒素水平最低，但它们的活性生物合成速率最高（图2）。另外RT-PCR表明已知通路基因的表达与同位素标记结果相匹配。此外，这一趋势适用于该途径的所有分支，所有AmA生物合成都位于同一组织内（图2b）。在水仙花中，对类似处理的组织进行DESI-MS空间质谱成像，进一步揭示在完整叶基组织中可以检测到更多的标记中间体，而在较老的组织中则相对较少。图像显示AmAs可能位于维管组织的近端（图2c）。

水仙花的年周期由休眠期和活跃生长期组成。在较冷的地区，随着春季气温的升高，鳞茎打破休眠，新的叶子开始从鳞茎内长出来。叶片伸长始于水仙花鳞茎内这些新生叶片基部的细胞分裂。总的来说，同位素饲养数据表明这些幼嫩的、新发育的叶片在露出地面进行光合作用之前就充满了生物碱毒素，从而揭示了石蒜属植物和其他可能的球茎植物中毒素生物合成的逻辑。在确定幼叶基部是活性生物合成位点之后，作者通过对生物合成活性组织进行RNA-seq测序来鉴定候选基因。

图2 稳定同位素前体饲养实验确定叶基部为活性生物合成位点。

2.转录组测序鉴定氧化偶联的候选P450酶

在将叶基鉴定为活性生物合成位点后，作者对水仙花的各种组织进行了转录组测序，包括幼叶基和老叶尖，以便鉴定候选基因。利用长读长Pacbio IsoSeq全长转录组测序，克服了多倍体水仙花（异源三倍体）二代组装的困难。结果发现是叶基组织中表达最高的细胞色素P450转录物之一，表明转录组测序已经捕获了相关的生物合成组织。在获得了一个高质量的转录组组装结果（BUSCO 89.1% 完整性），并捕捉到了活性生物合成位点之后，作者首先试图鉴定用于AmA生物合成关键步骤的酶，即以三种不同方式氧化4OMN，生成和骨架，后续的物质多样性都是由这些骨架产生的（图3A）。

在寻找能够将4OMN氧化偶联到 和 中间体demethylnarwedine （8）和noroxopluviine的酶时，作者锁定到细胞色素P450候选物，这是一个已知的催化广泛氧化反应的植物酶家族。本研究共选择了33个在叶基部高表达、在叶顶部低表达的P450进行研究（图3B），其中几个与具有特别高的同源性（>80%的核苷酸同一性）。由于已被证明可以以4OMN作为底物来产生型产物noroxomaritidine（2），作者推断这些同源物可能会催化来自共同底物的氧化偶联。酶氨基酸组成的微小变化可以显著影响其催化区域选择性。例如，拟南芥P450s 和在氨基酸水平上有89%的相似性，但在camalexin生物合成中氧化相同的底物产生不同的产物。

因此，作者克隆了转录组中所有的同源基因，使用农杆菌介导的瞬时T-DNA表达在烟草叶片中直接与4OMN底物共渗透。通过LC/MS分析发现如预期的那样，产生了一个主要峰，其MS/MS碎裂模式符合2号产物，即产物（图3D）。大多数其他候选基因要么产生相同的产物，要么没有产生预期[M+H]+ = m/z 272.1281的氧化产物（图3D）。然而，一个类似的P450酶，，是的一个同源基因，其核苷酸水平的相似性为91%，产生了中间体8，通过对羰基进行甲基化和还原，可以生成加兰他敏。

图3 三种高度相似的氧化偶联细胞色素P450同源蛋白是AmAs多样性生成的关键。

’模式氧化偶联酶的鉴定

由于4OMN和和产物的氧化偶联酶都与CYP96家族的p450密切相关，作者推测o-p’模式氧化偶联酶也可能是同一CYP96家族中一个密切相关的P450。然而，尽管对候选p450进行了广泛的测试，但在在异源测试系统中表达这些候选酶后，未能鉴定出这种酶。但生物碱是百合科植物中最丰富的生物碱之一，前面的研究也表明，它在叶基中积极合成（图3B）。作者推测未鉴定到这些酶到原因，可能是这些酶在异源宿主中蛋白质表达较差。由于在水仙花叶基的前体饲喂实验中观察到了活性生物合成，因此用于石蒜碱生物合成的相关酶也应存在于作者发现的和途径生物合成基因的叶基表达酶列表中。作者认为如果所有候选酶同时瞬时表达到同一片叶子中，可能能够鉴定出正确的一组酶，至少部分重建叶片中的石蒜碱途径。

作者鉴定、克隆并同时对携带酶编码基因T-DNA的农杆菌菌株进行共侵染，这些基因与高度共表达。将这些候选基因在不同组合中进行了测试，组合是根据假定的酶功能来分组的；在同一片叶子的侵染中，一次最多包含了26个候选基因。由于在同一片叶子中侵染了多种类型的酶，不知道会产生哪些途径中间体，因此作者进行了半靶向搜索，寻找与预期m/z值相符的质量特征，这些预期值是根据先前标记研究推定的途径中间体。其中一组包括P450和NAD（P）结合Rossman Fold家族蛋白的共渗透实验中，观察到在正电离模式下产生了m/z值为的信号特征，这与预期的质量([M+H]+)相符，是经过还原的氧化偶联产物。MS/MS与标准品的比较分析表明，该物质是 途径中的一种中间体norpluviine（7）（图3）。

norpluviine是由（一种CYP96T1-like细胞色素P450）和（一种短链醇脱氢酶/还原酶）共渗透产生的。单独使用和都不会产生7（图3C），表明与和p-o' 途径类似，氧化4OMN，然后将产物还原为7，但当单独测试时，无法检测到预期的4OMN氧化中间体，相反观察到一组具有不同质量的峰，该质量特征可能是7生物合成中的真正中间体，也可能是在没有的情况下产生的不稳定副产物。随着同源物的鉴定，本研究已识别出三种氧化偶联模式的P450酶，而且还揭示了一组密切相关的同源物，可能是通过复制和功能分化形成的，它们在同一底物4OMN上催化三种不同的氧化偶联模式，生成赋予AmAs多样性的基本骨架。总的来说，该结果揭示了石蒜科生物碱多样性生成的主要途径，并为未来将这些生物活性代谢物工程化到异源系统奠定了基础。

4.定点突变揭示了氧化偶联P450s区域选择性差异的基础

氧化酶和能够将4OMN前体催化生成haemanthamine和galantamine骨架，它们在核苷酸水平上表现出91%的同一性（在氨基酸水平上为86%）。作为和骨架生物合成中的关键酶，这些酶可能对于决定4OMN流向以及haemanthamine和galantamine这两种生物活性天然产物的合成至关重要（图3a）。虽然天然的序列仅产生微量的产物2，但其同源物显示出相反的区域选择性，产物8为主要观察到的产物（图3D）。由于galantamine是一种乙酰胆碱酯酶抑制剂，而haemanthamine是一种真核核糖体抑制剂，它们似乎表现出相互排斥的生物活性，因此作者试图了解产生它们骨架分歧的不同区域选择性氧化的结构基础。作者认为，鉴定和中决定区域选择性的残基，可以控制这些生物活性代谢物的相对前体通量。

作者首先寻找和序列之间在底物识别位点（SRSs：是已知对P450催化中的底物识别和结合很重要的基序）的氨基酸差异。然后搜索了其他公开报道编码AmAs生成的直系同源蛋白，并鉴定出在直系同源中保守的残基。通过寻找和的SRSs差异，共确定了四个候选位点，这些位点可能会在和中产生区域选择性氧化（图3E）。

接下来，作者对这四个区域分别进行了序列交换突变，并评估了交换残基对催化区域选择性的影响。作者克隆了突变体，该突变体包含这四个基序中每个基序相应的残基，并在瞬时表达系统中测试了这些突变体。其中，三个突变基序不影响产物区域选择性，但当上的一个丙氨酸突变为其对应的的亮氨酸时，赋予了催化氧化偶联的能力（图3F）。通过序列分析、同源性建模和底物对接对该位点进一步分析，发现A308位点位于的氧结合基序中，并且与底物4OMN的预测结合位点在空间上非常接近。总的来说，这些结果表明水仙花中的生物碱通量可以由高度相似的酶控制，其中一个氨基酸突变可以产生完全不同类别的生物活性AmAs。

和加兰他敏核心生物合成途径的鉴定

在中重建了haemanthamine和加兰他敏生物合成中的第一步之后，接下来开始寻求它们生物合成中剩余步骤未被表征的酶。由于植物代谢途径倾向于共表达，作者使用了化学结构分析和共表达分析相结合的方法来识别haemanthamine和加兰他敏生物合成途径中剩余的候选基因（图4）。之前的底物饲养实验已经鉴定了haemanthamine和加兰他敏生物合成途径中的潜在中间体。haemanthamine的生物合成被认为是通过将前体4OMN与noroxomaritidine（2）进行氧化偶联，然后将酮还原为normaritidine（3），产生亚甲二氧基桥和vittatine（4），随后进行羟基化得到11-hydroxyvittatine（5），最后进行O-甲基化以生成Haemanthamine。使用生物合成的作为诱饵，搜索了共表达的转录本，这些转录本编码的酶能够催化Haemanthamine生物合成的下游转化。

通过在转录组数据中搜索具有NAD(P)-结合的Rossman Fold蛋白，鉴定了可能将2还原为3的候选酮还原酶。在中利用农杆菌介导的瞬时T-DNA表达，发现了一个名为的肉桂酰辅酶A还原酶，当与产生2的共表达，并喂养底物4OMN时，产生了具有3的预期裂解模式产物（图4A）。接下来，寻找能够将3氧化以生成亚甲二氧基桥和4的共表达酶。P450s是多功能氧化酶，之前已在植物中被证明能够催化植物中愈创木酚部分形成亚甲二氧基桥。因此，作者将搜索重点放在了候选P450s上。鉴定到，这是一种CYP71家族蛋白，在瞬时表达系统中产生了4（图4A）。为了将4羟基化为5，作者再次转向寻找共表达P450和2-酮戊二酸依赖性双加氧酶（ODD）。这两类酶属于植物王国中最大的代谢酶家族，并且之前已被报道能够羟基化非活性碳。寻找到，这是一种能够将4羟基化为5的ODD，在瞬时表达系统中得到了验证。为了Haemanthamine生物合成中的最后一步，即在C-3羟基上的O-甲基化，作者搜索了共表达的甲基转移酶（MTs）。通过在瞬时表达系统中与和4OMN前体共侵染，鉴定到NtOMT1作为11-hydroxyvittatine的O-甲基转移酶，产生了Haemanthamine（图4A）。总之随着的鉴定，作者发现了真核蛋白合成抑制剂Haemanthamine的核心生物合成途径，并在异源宿主中重建了其生物合成通路（图4A）。

随着Haemanthamine完整核心途径的发现，作者接下来转向鉴定阿尔茨海默病治疗药物加兰他敏生物合成的候选基因。加兰他敏的核心途径需要4OMN氧化为8，N-甲基化为9，并将9酮还原为加兰他敏。由于作者已经发现是从4OMN产生8的氧化酶，因此作者寻找了共表达甲基转移酶的候选酶，鉴定到，这是一种γ-生育酚甲基转移酶，催化产物8产生9（图4B）。接下来，为了鉴定可以将9还原为加兰他敏的酶，作者寻找了共表达的NAD（P）结合Rossman Fold家族蛋白，鉴定到一种醛酮还原酶，它将9还原成加兰他敏。通过鉴定和，确定了FDA批准的阿尔茨海默病治疗药物加兰他敏生物合成的最小核心基因集。这些新发现的Haemanthamine和加兰他敏生物合成酶共同揭示了4OMN是如何被加工成两种具有正交生物活性、结构不同的活性天然产物的。

图4 烟草中haemanthamine和galantamine核心生物合成途径的重建。

6.藜芦甾体生物碱的同位素标记研究为球茎植物防御代谢产物的生物合成提供了普遍性范例

在季节性地下球茎植物中，将防御毒素生物合成定位到新发育的叶片组织对于保护光合组织免受草食性动物的侵害至关重要。作者已经发现，在水仙花中，石蒜科生物碱是在新分裂的叶片组织中产生的，因此作者试图评估其他非石蒜科的地下球茎植物是否也表现出与防御毒素生物合成类似的发育相关性。在石蒜科之外，许多不同的植物物种展现出地下储藏器官支持短期、季节性生长周期的生活方式。在这些植物中，作者将研究重点放在药用植物藜芦属上，藜芦属产生甾体生物碱，如环巴胺，众所周知，环巴胺通过抑制Sonic hedgehog信号通路产生发育毒素，其中一些通路酶已被报道。

之前的喂养研究表明，甲羟戊酸途径产生了藜芦甾体糖苷生物碱的核心萜类骨架。作者假设向藜芦喂养C标记的甲羟戊酸途径关键前体醋酸盐，会导致C同位素进入该途径，从而能够追踪藜芦组织中的活性生物合成。与水仙花的饲养实验类似，将藜芦叶的切片浸泡在C标记的醋酸盐溶液中，通过跟踪C标记，发现藜芦碱是一种已知在藜芦属植物中积累的甾体生物碱中间体（图5）。对不同组织进行标记分析表明，藜芦像水仙花一样，叶片中的活性生物合成定位在叶基部新分裂的幼嫩区域。作者使用RT-PCR证实了已知的环巴胺途径基因，与C同位素标记结果相匹配（图5）。该研究为未来发现藜芦中这些具有重要药用价值的甾体生物碱生物合成途径奠定了基础。

图5 藜芦叶的取食研究表明叶基部是甾体生物碱发育毒素的活性生物合成位点。

本研究通过同位素标记、RT-qPCR，发现石蒜科生物碱的生物合成位于水仙花叶基部的新生生长组织，DESI-MS空间代谢组分析显示AmAs位于维管组织的近端。随后通过RNA-seq基因共表达分析鉴定了Haemanthamine和加兰他敏核心生物合成途径的候选基因，并利用关键前体4OMN和烟草表达系统，在异源宿主中重建了Haemanthamine和加兰他敏的生物合成通路。除此之外作者还评估了其他非石蒜科地下球茎植物是否也表现出与防御毒素生物合成类似的发育相关性，在药用植物藜芦中发现甾体生物碱（如环巴胺）的生物合成也发生在幼叶叶基分生组织中。本研究揭示了石蒜科生物碱的生物合成途径及其在发育梯度中的变化，为相关领域的研究提供了新的视角和思路。


应粉丝要求，测评出光IFG5全合成机油的具体使用表现

前段时间粉丝快递了两瓶出光IFG50w20低粘度全合成机油过来，希望小编能对出光实际使用表现进行评测。为了满足粉丝需求，我改变了原有的工作计划。近三个月以来，我的主要工作就是开着更换出光IFG5机油的雅阁飞驰。不负粉丝所托，更换机油后，总行驶里程已超10000公里，对机油在低温流动性、燃油经济性、动力提升及驾驶感提升、耐久性等方面的表现有了一个初步的结果。

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评测总结：

通过本次评测，我肯定出光IFG5低粘度全合成机油在低温流动性、燃油经济性、动力输出和发动机保护等方面的出色的表现，车主们可放心使用。